响应面法优化高效美白霜功效成分配比
未知 - Best Carrier 2022-12-02
陈丹1，洪延涵1，魏天宝2，闻庆1，刘卫2,3#
（1 武汉百思凯瑞生物科技有限公司，武汉 430075；2 华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074；3 华中科技大学国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430075）摘要: 通过优化美白功效成分配比，为开发高效美白霜提供实验依据。以酪氨酸酶抑制率和自由基清除率为评价指标，通过响应面实验设计，优化不同美白功效成分的复合配比，制备高效美白霜。模拟最大化意愿预测结果获得最佳功效成分质量配比为α - 熊果苷︰光甘草定︰Vc乙基醚︰烟酰胺=269.8︰2.23︰231.9︰104.5，此复配比例下的酪氨酸酶抑制率为95.81%，自由基清除率为86.17%。实验表明，用响应面法模拟预测的酪氨酸酶抑制率、自由基清除率与实测值重合性好，响应面法可有效应用于高效美白霜中功效成分配比的研究。
关键词：响应面设计法；高效美白霜；酪氨酸酶抑制率；自由基清除率
Response Surface Method for Optimizing Proportion of Functional Ingredients in High Effective Whitening Cream
CHEN Dan1, HONG Yan - han1, WEI Tian - bao2, WEN Qing1, LIU Wei2,3
(Wuhan Bestcarrier Biotechnology., Ltd., Wuhan 430075,Hubei, China; 2 National Engineering Research Center for Nanomedicine, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430075, Hubei, China; 3. College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, Hubei, China）Abstract: To provide experimental basis for developing high - effective whitening cream, the ratio of whitening functional ingredients in formulation was optimized. With tyrosinase activity inhibition rate and free radical scavenging activity rate as evaluation indexes, through response surface optimization design, the proportion of whitening functional ingredients in formulation was optimized to obtain high effective whitening cream. The results of prediction of simulative maximized willingness for whitening efficacy were α - arbutin︰glabridin︰ethyl ascorbic acid︰niacinamide= 269.8/2.23/231.9/104.5(mass ratio). The real experimental value of the tyrosinase activity inhibition rate was 95.81%, the free radical scavenging activity was 86.17%. As a result, the predicted value of the tyrosinase activity inhibition rate and the free radical scavenging activity rate though response surface method were very similar to the experimental value. Response surface method can be effectively applied in the study of the effective proportion of functional ingredients in high effective whitening cream.
Keywords: response surface method; high effective whitening cream; tyrosinase activity inhibition rate; free radical scavenging activity rate
由于工作、生活压力的增加和自然环境日趋恶劣，皮肤暗黄、色素沉着等不良症状越来越多见，因此，美白祛斑化妆品越来越受到人们的青睐。皮肤中的黑色素含量决定了肤色的深浅，酪氨酸酶被视为黑色素合成过程中的关键酶与限速酶，抑制该酶活性直接影响黑素合成速率与数量[1]。氧自由基可诱导皮肤角质层释放α - 黑素细胞刺激素等因子，从而促进黑素合成[2]。因此，抑制酪氨酸酶活性和清除自由基是目前美白化妆品的重要评价指标。α - 熊果苷、光甘草定、Vc乙基醚和烟酰胺是常用的美白功效成分[3]。α - 熊果苷对酪氨酸酶具有很好的抑制作用，同时具有抗氧化作用，并且不会抑制人体细胞的生长，但有效剂量较高[4]。光甘草定被誉为“美白黄金”，主要通过竞争性抑制酪氨酸酶活性，从而抑制黑色素的合成[5]。Vc及其衍生物则可阻止黑色素的氧化过程、清除氧自由基、还原黑色素中间体和黑色素的聚合物来抑制黑色素的产生[6]。烟酰胺能抑制角质形成细胞对黑素小体的吞噬，从而抑制黑素小体的转运[7]。将这4种功效成分共同应用于美白产品中，可通过多个途径美白皮肤，但如何确定最佳配伍，使多靶位效应目标都处于较好水平且副作用相对最小，是开发高效美白霜需要解决的重要问题[8]。
响应面设计法（Response Surface Methodology, RSM）采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，其试验次数少、精密度高[9]。本文采用响应面设计法，探讨4种美白功效成分联合使用时对酪氨酸酶活性的抑制和对自由基的清除能力，以明确功效成分间的复配比例和协同作用，为美白化妆品的开发提供实验依据。
1 实验部分
1.1主要试剂及仪器
α - 熊果苷（广州乐尔康生物科技股份有限公司）、Vc乙基醚（济南永扬药业有限公司）、光甘草定（新疆隆惠源药业有限公司）、烟酰胺（广州思益生物科技有限公司）、1,1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（DPPH，梯希爱上海化成工业发展有限公司）、L - 酪氨酸、L - 酪氨酸酶（北京索莱宝科技有限公司）。
辛酸/癸酸甘油三酯、异壬酸异壬酯、氢化蓖麻油345、硬脂醇聚醚 - 21、硬脂醇聚醚 - 2、十六十八醇、丙二醇、丁二醇、尿囊素、卡波姆2020、三乙醇胺、丙烯酸钠/二甲丙烯酰牛磺酸钠/异十六碳烷/聚山梨酸酯80丙烯酸，均为化妆品级成分。
电子天平（梅特勒-托利多）、二氧化碳培养箱（日本SANYO）、多标记酶标仪（美国 Perkin Elmer）、分散机（德国IKA）。
1.2 实验方法
1.2.1 酪氨酸酶抑制能力检测
将100 μL不同浓度样品溶液和50 μL的200 U/mL酪氨酸酶依次加入到96孔板中，37 ℃孵育10 min，之后加入50 μL 的质量分数0.05% L - 酪氨酸，混匀，在37 ℃温育30 min，在490 nm处测量其吸光度。以样品溶剂作为空白对照。酪氨酸酶抑制率（%）=（A0－As）/ A0×100%，其中A0是空白对照吸光度，As为样品吸光度[10]。
1.2.2 DPPH自由基清除能力检测
将0.25 mM DPPH 溶液100 μL和不同浓度样品溶液100 μL依次加入到96孔板中，暗处静置30 min，490 nm处测定其吸光度，以样品溶剂作为空白对照。自由基清除率（%）=（A0－As）/ A0×100%，其中A0是空白对照吸光度，As为样品吸光度[11]。
1.2.3 响应面法优化美白功效成分配比
采用响应面设计的Box - Behnken原理，对A（α - 熊果苷）、B（光甘草定）、C（Vc乙基醚）、D（烟酰胺）四因素进行试验设计。试验因素水平及编码见表1。
表1 Box - Behnken设计试验因素水平及编码
| 水平编码 | 因素 | |||
|
A，α - 熊果苷浓度 （mg/L） |
B，光甘草定浓度 （mg/L） |
C，Vc乙基醚浓度 （mg/L） |
D，烟酰胺浓度（mg/L） | |
| -1 | 100 | 0.5 | 50 | 100 |
| 0 | 300 | 1.5 | 150 | 300 |
| 1 | 500 | 2.5 | 250 | 500 |
1.2.4 验证试验
通过JMP软件的最大化意愿得到美白共输送功效成分的最优配比，精密称量最优配比量的4种功效成分，定容至1 L，混匀，测定酪氨酸酶抑制率和自由基清除率，试验重复3次。
1.2.5 高效美白霜的制备
按照表2制备高效美白霜，称取相应质量的各物质，将B相各原料置于75℃水浴锅中搅拌30 min，使固状物熔融；将A相中各原料置于配方中75℃水浴锅中搅拌均匀加入B相，使用分散仪12000 r/min下剪切5 min。待美白霜冷却至室温后，加入C相和D相，搅拌均匀，既得高效美白霜。
通过JMP软件的最大化意愿得到美白共输送功效成分的最优配比，精密称量最优配比量的4种功效成分，定容至1 L，混匀，测定酪氨酸酶抑制率和自由基清除率，试验重复3次。
1.2.5 高效美白霜的制备
按照表2制备高效美白霜，称取相应质量的各物质，将B相各原料置于75℃水浴锅中搅拌30 min，使固状物熔融；将A相中各原料置于配方中75℃水浴锅中搅拌均匀加入B相，使用分散仪12000 r/min下剪切5 min。待美白霜冷却至室温后，加入C相和D相，搅拌均匀，既得高效美白霜。
表2 高效美白霜的制备
采用JMP软件进行Box - Behnken设计及结果分析。
2结果与讨论
2.1 响应面设计法优化美白功效成分配比
目前考察功效成分的配比多用正交试验的方法，采用正交试验只能单个孤立进行实验点分析，建立的数学模型预测性差。响应面设计考察相等因素数的情况下试验要比正交设计多，但得到的非线性拟合模型的预测性更好，且能研究几种因素间交互作用，能快速地对优选的参数进行全面研究，实验结果准确可靠，可广泛应用于配方的确定。本实验以酪氨酸酶抑制率和自由基清除率为响应值，采用Box - Behnken设计优化美白功效成分配比，目标是得到兼具抑制酪氨酸酶和抗氧化效果的最优配方。采用JMP软件进行Box - Behnken设计，具体实验设计和结果见表3。
表3 美白功效成分配比Box - Behnken试验结果
| 试验号 | A | B | C | D | 酪氨酸酶抑制率/% | 自由基清除率/% |
| α - 熊果苷浓度（mg/L） | 光甘草定浓度（mg/L） | Vc乙基醚 浓度（mg/L） | 烟酰胺 浓度（mg/L） | |||
| 1 | 500 | 1.5 | 50 | 300 | 93.42 | 78.82 |
| 2 | 300 | 1.5 | 150 | 300 | 94.12 | 81.38 |
| 3 | 500 | 2.5 | 150 | 300 | 95.18 | 83.36 |
| 4 | 500 | 1.5 | 150 | 500 | 94.06 | 82.26 |
| 5 | 300 | 2.5 | 150 | 500 | 95.53 | 76.40 |
| 6 | 100 | 1.5 | 50 | 300 | 92.18 | 63.35 |
| 7 | 300 | 1.5 | 150 | 300 | 93.54 | 82.42 |
| 8 | 500 | 1.5 | 250 | 300 | 93.89 | 86.36 |
| 9 | 500 | 0.5 | 150 | 300 | 82.67 | 84.46 |
| 10 | 100 | 1.5 | 150 | 500 | 92.77 | 77.29 |
| 11 | 100 | 0.5 | 150 | 300 | 77.86 | 80.12 |
| 12 | 500 | 1.5 | 150 | 100 | 94.30 | 85.45 |
| 13 | 300 | 2.5 | 250 | 300 | 95.46 | 85.29 |
| 14 | 300 | 1.5 | 150 | 300 | 93.42 | 82.33 |
| 15 | 300 | 0.5 | 50 | 300 | 83.78 | 72.77 |
| 16 | 300 | 2.5 | 50 | 300 | 95.58 | 72.75 |
| 17 | 300 | 1.5 | 250 | 500 | 93.89 | 83.65 |
| 18 | 100 | 1.5 | 250 | 300 | 93.16 | 84.13 |
| 19 | 300 | 0.5 | 150 | 500 | 84.15 | 79.28 |
| 20 | 300 | 1.5 | 50 | 500 | 93.58 | 69.70 |
| 21 | 300 | 0.5 | 150 | 100 | 84.58 | 85.09 |
| 22 | 300 | 1.5 | 250 | 100 | 93.55 | 87.08 |
| 23 | 300 | 1.5 | 50 | 100 | 93.55 | 75.49 |
| 24 | 300 | 0.5 | 250 | 300 | 83.23 | 85.56 |
| 25 | 300 | 2.5 | 150 | 100 | 95.46 | 84.76 |
| 26 | 100 | 2.5 | 150 | 300 | 95.65 | 78.98 |
| 27 | 100 | 1.5 | 150 | 100 | 92.48 | 82.09 |
2.1.1响应酪氨酸酶抑制率结果
对酪氨酸酶抑制率数据进行拟合回归分析，所得回归方程式为：Y1=93.69+0.78A+6.38B+0.090C+4.036E－003D－1.32AB－0.13AC－0.13AD+0.11BC+0.12BD+0.077CD－0.89A2－4.46B2+0.062C2+0.39D2。通过对模型进行回归方程系数显著性检验可知，一次项A、B，交互项AB，二次项B2显著，因此不是简单线性关系，表明回归模型的意义和真实度良好。表4列出了响应酪氨酸酶抑制率方差分析结果。
对酪氨酸酶抑制率数据进行拟合回归分析，所得回归方程式为：Y1=93.69+0.78A+6.38B+0.090C+4.036E－003D－1.32AB－0.13AC－0.13AD+0.11BC+0.12BD+0.077CD－0.89A2－4.46B2+0.062C2+0.39D2。通过对模型进行回归方程系数显著性检验可知，一次项A、B，交互项AB，二次项B2显著，因此不是简单线性关系，表明回归模型的意义和真实度良好。表4列出了响应酪氨酸酶抑制率方差分析结果。
表4 响应酪氨酸酶抑制率方差分析结果
| 源 | SS | ƒ | MS | F值 | P值 | 显著性 |
| 模型 | 638.07 | 14 | 45.58 | 40.1 | < 0.0001 | ** |
| A | 7.39 | 1 | 7.39 | 6.51 | 0.0254 | * |
| B | 488.82 | 1 | 488.82 | 430.12 | < 0.0001 | ** |
| C | 0.097 | 1 | 0.097 | 0.086 | 0.7747 | |
| D | 0.0002 | 1 | 0.0002 | 0.0002 | 0.9898 | |
| AB | 6.98 | 1 | 6.98 | 6.14 | 0.0291 | * |
| AC | 0.063 | 1 | 0.063 | 0.055 | 0.8177 | |
| AD | 0.07 | 1 | 0.07 | 0.062 | 0.8076 | |
| BC | 0.048 | 1 | 0.048 | 0.042 | 0.8410 | |
| BD | 0.062 | 1 | 0.062 | 0.054 | 0.8199 | |
| CD | 0.023 | 1 | 0.023 | 0.021 | 0.8881 | |
| A2 | 4.24 | 1 | 4.24 | 3.73 | 0.0773 | |
| B2 | 105.87 | 1 | 105.87 | 93.16 | < 0.0001 | ** |
| C2 | 0.021 | 1 | 0.021 | 0.018 | 0.8949 | |
| D2 | 0.82 | 1 | 0.82 | 0.72 | 0.4121 | |
| 残差 | 13.64 | 12 | 1.14 | |||
| 失拟项 | 13.35 | 10 | 1.34 | 9.35 | 0.1004 | |
| 误差 | 0.29 | 2 | 0.14 | |||
| 总和 | 651.71 | 26 |
观察响应曲面的倾斜度和等高线紧密度，确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡，等高线越密集，说明两者交互作用越显著。图1列出的不同因素对酪氨酸酶抑制率影响的3D曲面图反映了各因素对酪氨酸酶抑制率响应值的影响，通过比较可知：光甘草定对酪氨酸酶抑制率的影响最显著，表现为曲线相对较陡；其次为α - 熊果苷，Vc乙基醚、烟酰胺的曲线相对较平滑，随其数值的增加或减少，响应值变化较小。
图1 不同因素对酪氨酸酶抑制率影响的3D曲面
2.1.2响应自由基清除率结果
对自由基清除率数据进行拟合回归分析，所得回归方程式为：Y2=82.04+2.90A－0.48B+6.60C－2.62D+0.009AB－3.31AC+0.40AD－0.062BC－0.64BD+0.59CD－0.38A2－0.11B2－3.09C2－0.14D2。通过对模型进行回归方程系数显著性检验可知，一次项A、C、D，交互项AC，二次项C2显著，表明回归模型的意义和真实度良好，α - 熊果苷和光甘草定对自由基清除有交互作用。由表5响应自由基清除率方差分析结果可知，失拟项无统计学意义，说明拟合度良好；模型P值＜0.01，说明模型回归高度显著。4个变量对自由基清除率的影响顺序为C＞A＞D＞B，说明对DPPH自由基清除的影响因素为Vc乙基醚＞α - 熊果苷＞烟酰胺＞光甘草定。回归系数R2为0.9992，说明利用此回归方程对实验结果进行计算是合理的。
对自由基清除率数据进行拟合回归分析，所得回归方程式为：Y2=82.04+2.90A－0.48B+6.60C－2.62D+0.009AB－3.31AC+0.40AD－0.062BC－0.64BD+0.59CD－0.38A2－0.11B2－3.09C2－0.14D2。通过对模型进行回归方程系数显著性检验可知，一次项A、C、D，交互项AC，二次项C2显著，表明回归模型的意义和真实度良好，α - 熊果苷和光甘草定对自由基清除有交互作用。由表5响应自由基清除率方差分析结果可知，失拟项无统计学意义，说明拟合度良好；模型P值＜0.01，说明模型回归高度显著。4个变量对自由基清除率的影响顺序为C＞A＞D＞B，说明对DPPH自由基清除的影响因素为Vc乙基醚＞α - 熊果苷＞烟酰胺＞光甘草定。回归系数R2为0.9992，说明利用此回归方程对实验结果进行计算是合理的。
表5 响应自由基清除率方差分析结果
图2 不同因素对自由基清除率影响的3D曲面
图3 最大化意愿预测
| 源 | SS | ƒ | MS | F值 | P值 | 显著性 |
| 模型 | 814.67 | 14 | 58.19 | 28.37 | < 0.0001 | ** |
| A | 100.61 | 1 | 100.61 | 49.06 | < 0.0001 | ** |
| B | 2.73 | 1 | 2.73 | 1.33 | 0.2711 | |
| C | 522.22 | 1 | 522.22 | 254.63 | < 0.0001 | ** |
| D | 82.15 | 1 | 82.15 | 40.05 | < 0.0001 | ** |
| AB | 0.0003 | 1 | 0.0003 | 0.0002 | 0.9901 | |
| AC | 43.82 | 1 | 43.82 | 21.37 | 0.0006 | ** |
| AD | 0.65 | 1 | 0.65 | 0.32 | 0.5832 | |
| BC | 0.016 | 1 | 0.016 | 0.0076 | 0.9320 | |
| BD | 1.62 | 1 | 1.62 | 0.79 | 0.3915 | |
| CD | 1.4 | 1 | 1.4 | 0.68 | 0.4255 | |
| A2 | 0.75 | 1 | 0.75 | 0.37 | 0.5556 | |
| B2 | 0.059 | 1 | 0.059 | 0.029 | 0.8682 | |
| C2 | 50.98 | 1 | 50.98 | 24.86 | 0.0003 | ** |
| D2 | 0.11 | 1 | 0.11 | 0.052 | 0.8230 | |
| 残差 | 24.61 | 12 | 2.05 | |||
| 失拟项 | 23.94 | 10 | 2.39 | 7.14 | 0.1290 | |
| 误差 | 0.67 | 2 | 0.34 | |||
| 总和 | 839.28 | 26 |
图2不同因素对自由基清除率影响的3D曲面图直观地反映了各因素对自由基清除率响应值的影响，比较6个图可知：Vc乙基醚对自由基清除率的影响最显著，其次为α - 熊果苷，光甘草定、烟酰胺的数值改变对响应值变化较小。
图2 不同因素对自由基清除率影响的3D曲面
2.2 验证试验
通过JMP软件的预测刻画器进行最大化意愿，结果如图3。预测的美白功效成分最优质量配比是α - 熊果苷︰光甘草定︰Vc乙基醚︰烟酰胺=269.8︰2.23︰231.9︰104.5。精密称取α - 熊果苷269.8 mg、光甘草定2.23 mg、Vc乙基醚231.9 mg，烟酰胺104.5 mg，用溶剂溶解后定容至1 L，混匀，测定酪氨酸酶抑制率和自由基清除率，进行3次重复试验。结果得到的平均酪氨酸酶抑制率为95.81%，平均自由基清除率为86.17%，均在预测范围内，表明采用响应面法优化高效美白霜功效成分配比具有可行性。
通过JMP软件的预测刻画器进行最大化意愿，结果如图3。预测的美白功效成分最优质量配比是α - 熊果苷︰光甘草定︰Vc乙基醚︰烟酰胺=269.8︰2.23︰231.9︰104.5。精密称取α - 熊果苷269.8 mg、光甘草定2.23 mg、Vc乙基醚231.9 mg，烟酰胺104.5 mg，用溶剂溶解后定容至1 L，混匀，测定酪氨酸酶抑制率和自由基清除率，进行3次重复试验。结果得到的平均酪氨酸酶抑制率为95.81%，平均自由基清除率为86.17%，均在预测范围内，表明采用响应面法优化高效美白霜功效成分配比具有可行性。
图3 最大化意愿预测
2.2 高效美白霜制备及感官评价
按照表2制备高效美白霜100 g，称取α - 熊果苷2.70 g、光甘草定0.02 g、Vc乙基醚2.32 g、烟酰胺1.04 g加入到A相中，其中4种功效成分从抑制酪氨酸酶、清除自由基、抑制黑素小体迁移等多个途径共同作用于皮肤发挥美白功效。取适量高效美白霜在室温和非阳光直射下观察，样品为乳白色，质地细腻、色泽均匀，易展开涂抹，无明显气味。
3 结论
本实验采用响应面设计，对高效美白霜中功效成分的配比进行了优化，通过试验数据分析，得到了拟合方程，直接反映了4种因素对酪氨酸酶抑制率和自由基清除率的影响及交互作用，得到符合设计目标的优化配方。结果表明，研制的高效美白霜可从抑制酪氨酸酶、清除自由基等多个途径抑制皮肤黑色素生成，具有良好的皮肤美白功效。
参考文献
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按照表2制备高效美白霜100 g，称取α - 熊果苷2.70 g、光甘草定0.02 g、Vc乙基醚2.32 g、烟酰胺1.04 g加入到A相中，其中4种功效成分从抑制酪氨酸酶、清除自由基、抑制黑素小体迁移等多个途径共同作用于皮肤发挥美白功效。取适量高效美白霜在室温和非阳光直射下观察，样品为乳白色，质地细腻、色泽均匀，易展开涂抹，无明显气味。
3 结论
本实验采用响应面设计，对高效美白霜中功效成分的配比进行了优化，通过试验数据分析，得到了拟合方程，直接反映了4种因素对酪氨酸酶抑制率和自由基清除率的影响及交互作用，得到符合设计目标的优化配方。结果表明，研制的高效美白霜可从抑制酪氨酸酶、清除自由基等多个途径抑制皮肤黑色素生成，具有良好的皮肤美白功效。
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